PEG的修饰作用

PEG的修饰作用和PEG修饰方法

PEG的修饰作用

摘要:聚乙二醇修饰即PEG化,是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。自Davis1977年首次用PEG 修饰牛血清白蛋白以来,PEG修饰技术广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰,多个PEG修饰药物上市或在临床研究中。 PEG修饰具有半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等。

关键词:PEG(聚乙二醇);修饰

高分子聚乙二醇(PEG)由于其毒性小、无抗原性、具有良好的两亲性,且生物相容性已获FDA认可,对蛋白质的改造具有无可取代的优势。聚乙二醇化修饰技术通过共价键,将聚乙二醇与被修饰药物耦联,改善药物的理化性质和生物学活性,这种技术现已广泛应用于蛋白质(肽类)、酶、抗体及小分子药物。

1 PEG化学结构及性质

1.1 PEG化学结构

结构式CH2(OH)-(CH2CH2O)n -CH2OH

 1.2 PEG性质【1】

聚乙二醇系列产品通常情况下溶于水和多种有机溶剂,不溶于脂肪烃、苯、乙二醇等,不会水解变质,有广泛的溶解范围和优良的相容性、很好的稳定性、润滑性、成膜性、增塑性、分散性等。系低毒物质,且无刺激性,属非离子型聚合物。

2 聚乙二醇修饰剂

根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同,修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型,对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。根据被修饰化合物包括蛋白质、多肽、单克隆抗体分子片段、以及小分子化合物等的不同分子量大小、分子结构以及其理化特性,公司采取不同的聚乙二醇化技术方法对这些化合物进行修饰【2,3】。

2.1随机修饰

随机修饰蛋白质多以赖氨酸的ε-NH2或α-NH2为修饰目标,由于赖氨酸在蛋白质内通常数量较多,这种修饰引起蛋白质中多个赖氨酸被修饰,得到的产物是聚乙二醇化修饰异构体的混合物,目前FDA批准的已经上市的聚乙二醇化新药多数为随机修饰的产物。

2.2定点修饰

聚乙二醇化定点修饰,是在随机修饰的基础上发展起来的第二代聚乙二醇修饰技术,通过对修饰方式、PEG修饰剂和反应pH等的优化选择,实现定点修饰,这种修饰所得的产物为均一产物,异构体少,活性保留较好,免疫原性大大降低。

2.2.1 N端氨基定点修饰

由于蛋白质、多肽中存在多个α-NH2 和ε-NH2基团,氨基的随机修饰可能导致药物活性的明显下降,这给蛋白质、多肽的修饰带来了障碍。目前我们采取对N端氨基定点修饰,特别是对于远离活性中心的 N端定点修饰可以有效地保持药物的原有生物活性。

2.2.2巯基定点修饰

结合基因工程技术或Mutagenesis等方法,将巯基或一些特异性基团引入到蛋白、多肽预设位点(如不影响活性的糖基化位点、抗原决定簇等)后,再进行对该基团的修饰,这样就可得到活性保留较高和免疫原性降低的定点修饰产物。

2.2.3羧基定点修饰

采用带酰肼活化基团的聚乙二醇衍生物对蛋白质、多肽进行羧基基团进行修饰, 同样可以获得定点的修饰产物。

2.2.4酶催化修饰

采用酶催化手段诱导聚乙二醇分子与蛋白质、多肽等分子上特定的位点进行定向修饰。此方法具有一下特点:1)不需要对原蛋白质、多肽进行结构改造,保持原化合物的理化特性不受改变;2)定点修饰;3)工艺简单,容易大规模化生产和质量控制。

3 PEG修饰对蛋白质的影响

3.1 增加溶解度和稳定性

药用PEG易溶于水和大多数极性溶剂,不溶于脂肪烃类、苯和矿物油等非极性溶剂【4】。随相对分子质量升高,起在急性溶剂中的溶解度逐渐下降。由于PEG共价连接蛋白质等高分子后,其天然构象产生一定的刚性,不易伸展失活,减少了分子内部基团的热震动,从而增加了热稳定性。

3.2 减少免疫原性和抗原性,降低毒副作用

消除或降低蛋白质等高分子的抗原性效果明显【5】。L-天门冬酰胺酶用PEG修饰后可消除抗原性。

3.3 延长血浆半衰期和增加体内系统暴露

许多蛋白质等高分子经PEG 修饰后,抗蛋白水解酶、抗抑制剂等失活因子的能力和热稳定性提高,其体内半衰期比天然蛋白质等高分子长,对提高蛋白质等高分子的药用疗效极具意义【6】。L– 天门冬酰胺酶经PEG 修饰后,体内半衰期可延长13 倍。

一些蛋白质等高分子经PEG 修饰后可改变组织的分布能力,能在血液中被靶器官选择性吸收【7】。

3.4 增加体内生物活性和疗效

一些PEG 修饰后的蛋白质等高分子抗蛋白水解酶水解、抗抑制剂、抗酸碱和有机溶剂等变性失活能力提高【8】。原因是PEG 所产生的空间屏蔽阻挡了失活因子的进攻。此外,蛋白质等高分子中对蛋白水解酶等失活因子敏感基团被修饰,使其能力提高。过氧化氢酶经PEG 修饰后,抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明显提高。

3.5 减少给药次数,降低病人痛苦

PEG 可使大多数蛋白质等高分子毒性减少,且本身无毒性(相对分子质量>1 000),相对分子质量为4000 的PEG 可按每千克体重16g 的剂量,以10%的溶液安全地注射入鼠、兔、猴等动物体内【9,10】,不伤害蛋白质和细胞【11】。

4 PEG 修饰的应用

化学药物或蛋白质药物等在产生作用的同时,一般都存在自身无法克服的问题; 如较短的作用周期,较大的抗免疫原性及毒副作用。聚乙二醇化技术是一种将聚乙二醇活化后链接到药物分子或药物表面的技术。聚乙二醇可以增加药物的水溶性,降低毒副作用,减少免疫原性,提高药物在体内的稳定性,同时延长药物循环半衰期。

4.1尿激酶(UK)

尿激酶主要是相对分子质量为31 300 和54 700的高分子物质。尿激酶是一种碱性蛋白酶,由肾脏产生,主要存在于人及哺乳动物的尿中,人尿平均含量5~6 U/ml。尿激酶也具有酯酶活力,目前已广泛应用于治疗各种心血栓和血栓梗塞疾病【12】。

   4.2 PEG的活化及对壳聚糖的修饰作用

用聚乙二醇 (PEG)修饰壳聚糖可望使二者的优良性质得到有利结合。提高壳聚糖作为生物医学工程材料的生物相容性 ,改进吸附性能等重要作用。PEG末端羟基可以进行多种活化【13】。

4.3人红细胞生成素(EPO)

沈富兵等【14】研究了PEG化重组人红细胞生成素(在动物体内的作用。经动物皮下注射后比较PEG化重组人红细胞生成素与普通人红细胞生成素在网织红细胞百分数、用药频度、肾性贫血纠正及对病模动物的保护作用。表明PEG化重组人红细胞生成素网织红细胞百分数升高持续时间可达7 d 以上,而普通人红细胞生成素组只能达到4 d ;在周剂量(0.08 μg/ 只)相同的条件下,PEG化重组人红细胞生成素 每周给药1 次,小鼠红细胞比容(HCT)增高15.3%,与普通人红细胞生成素每周给药3 次的HCT 增高13.4% 的效果相当,而与普通人红细胞生成素每周用药1 次的HCT 增高6.0% 有明显差异。在病模大鼠的贫血治疗实验中,PEGEPO不仅每周1 次给药能达到普通人红细胞生成素每周3 次给药的效果,而且对患病大鼠的死亡保护作用也远优于普通人红细胞生成素。说明PEG化重组人红细胞生成素作用时间持久,用药次数少,纠正贫血效果明显,保护效果良好。

5结语

以上所述的以PEG 修饰的蛋白质等高分子虽然具有一定的代表性,但仅仅是此方面的部分实例。相信随着生物经济时代的来临,以PEG 修饰蛋白质等高分子将会得到更多的应用,会为人类的健康和社会的进步作出更大的贡献。

PEG修饰方法—聚乙二醇修饰蛋白质的活化与检测方法
摘要 聚乙二醇共价修饰蛋白质药物可以消除蛋白质药物的抗原性及免疫原性 延长小分子

多肽在体内的半衰期本文对该项技术最近的制备分离分析方法及各种方法的优缺点作一介绍并对不同蛋白质需采用的分析方法提出了一点建议。

关键词聚乙二醇 修饰 活化 分离 分析

近年来随着基因工程技术的发展用于疾病治疗的多肽酶细胞因子等蛋白类药物越来越多地被研究开发这类药物具有专一性强时效高等优点但也有许多不尽人意的地方如(1)大多数药物具有抗原性及免疫原性(2)容易从循环系统中被快速清除(3)定位给药困难(4)不稳定容易被酶类降解且来源稀少等[1] 为了克服基因工程蛋白类药物的上述缺陷许多研究人员正设法对蛋白质进行结构改造或化学修饰[2~4]

化学修饰法是指在分子水平上对蛋白质进行改造,即在体外将蛋白质的侧链基团通过人工方法与一些化学基团,特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接,从而改变蛋白质的性质。

        其主要优点是可以延长蛋白质在体内的半衰期、降低免疫原性和抗原性;另外还可以减弱蛋白酶的水解作用,增加蛋白分子的可溶性等。蛋白质的免疫原性是由于其分子表面的抗原簇所决定的,应用线性、亲水、惰性的高分子与蛋白质的非活性必需基团结合,在其表面形成屏蔽,使其不被识别不产生相应抗体,从而抑制相应的免疫反应;而连接大分子聚合物后,药物的分子量显著增大,不易被肾小球所过滤,从而延长在体内的半衰期。另外,由于大分子亲水性、聚合物的表面遮蔽作用在一定程度上减少了蛋白药物与蛋白酶的相互作用,使药物的稳定性进一步提高用于蛋白质修饰的大分子,很多常见的有如下类型聚乙二醇(包括聚乙二醇PEG和单甲基聚乙二醇mPEG) 多糖类如葡聚糖、右旋糖酐、淀粉等同源蛋白质及人工合成的多肽,如聚丙氨酸等,其中聚乙二醇由于其良好的生物相容性、反应简单、价格低廉等优点,受到较多的重视[1] 本文着重介绍聚乙二醇修饰蛋白质的活化方法分离纯化及其分析方法等。

1 聚乙二醇的活化

聚乙二醇修饰蛋白质主要通过聚乙二醇的末端羟基与蛋白质的氨基酸残基反应而实现,但聚乙二醇的末端羟基活性很差,很难在温和的环境中与蛋白质进行偶联反应,所以必须使用活化剂活化该羟基,使活化的聚乙二醇能在温和的环境中对蛋白质进行共价修饰。近年来聚乙二醇的活化方法已成为该领域的研究热点之一。

1.1 非特异性活化方法

1.1.1 溴化氰法 色谱或层析的固相载体最早的活化方法之一即溴化氰活化法 高pH 时溴化氰与载体内部的羟基反应转化成氰酸酯和亚氨基碳酸酯后来该方法也应用于带羟基的高分子聚合物的活化其方法操作简单容易重复而且反应环境温和但其偶联后的配基(包括蛋白质R-NH2)很容易脱落这种脱落主要是由于活化载体和含氨基配基之间形成不稳定的异脲键所引起的[5] 加之溴化氰有毒操作须在通风橱中进行该方法逐渐被其它方法所取代。

1.1.2 羰基二咪唑法  该方法最早用于多肽的合成 被证明是形成酰胺键的良好试剂含羟基的载体可与羰基二咪唑(CDI)反应得到活泼的酰基咪唑蛋白中赖氨酸残基的伯氨基可与其迅速反应形成稳定的酰胺键这种化学键比较稳定偶联上的蛋白不易脱落[5]。

CDI 活化PEG 需注意(1)CDI 遇水生成CO2 和咪唑所以活化反应宜在有机溶剂中进行且溶剂不能含水(2)活化后的聚乙二醇最好在低温下洗涤以保持高反应活性(3)活化后的聚乙二醇应用冷冻干燥法除去残留的有机溶剂以免使偶联的蛋白失效(4)偶联蛋白质的缓冲液中勿含有胺类(如Tris 或甘氨酸) 否则它将与待连接的蛋白分子竞争偶联。

1.1.3 N-羟基琥珀酰亚胺法 (a)N,N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化此反应也需要在无水条件下进行。

(b)琥珀酸酐及N–羟基琥珀酰亚胺活化 该方法活化得到的聚乙二醇活性较高最好是在非水环境中进行蛋白的偶联但对于多数生物大分子来说都是优先考虑水溶液系统而且在4°CpH=8 时活化聚乙二醇在水中的半衰期为20min 左右所以偶联反应最好在低温下20min 内完成,周笑艳等用该方法对天冬酰胺酶进行修饰取得了较好的效果[4]

1.1.4 氰脲酰氯法  氰脲酰氯又名三氯化嗪(TST) 是对称杂环化合物含有三个活性酰氯键广泛应用于染料行业TST 上的三个氯原子很容易发生亲核取代反应而且一个氯原子的取代可以稳定其它酰氯键所以第一个氯原子在4°C 就可以反应第二个在25°C 反应第三个在80°C 才反应David 等利用TST 与聚乙二醇上的羟基反应只有一个氯原子被取代其它的氯原子与蛋白质的氨基反应为抑制氯原子的亲核活性以控制反应的速度及修饰度可先加入苯胺取代其中一个氯原子剩下的氯原子用于蛋白质的偶联该反应虽说简单易行但由于TST的毒性以及卤原子过强的亲核活性使其应用受到限制

1.1.5 光气参与的活化方法  Kurfuerst 等在其专利中提到一些方法[6] 分别用N-羟基琥珀酰亚胺钾盐硝基苯酚及三氯苯酚与光气反应制备活化聚乙二醇活化主要分两步如图6 所示。

这些活化剂都应与聚乙二醇在有机相反应操作方法类似活化效果和配基偶联效果还没有具体评价但该反应由于有光气参与毒性极强增加了操作的复杂性。

1.1.6 改变聚乙二醇结构以提高修饰效果改变聚乙二醇的结构 将聚乙二醇的结构由线状改为叉状或梳状也可以起得到更好的修饰效果。

其优点主要体现在

(1)叉状聚乙二醇可以减少蛋白酶与蛋白质的接触以减弱其水解作用

(2)聚乙二醇结构变化造成的空间位阻效应减少了聚乙二醇与蛋白质的结合位点减少蛋白质失活

(3)聚乙二醇对蛋白质的屏蔽效应更为显著更好地降低蛋白药物的抗原性和免疫原性

Schiavon 等用线状和叉状聚乙二醇分别修饰尿酸酶[8] 结果如表1

由表1 可以看出叉状聚乙二醇修饰蛋白质可以很好地保留蛋白的生物活性,另外通过增长活化端与聚乙二醇链之间的距离或在a-C 上增加支链可以延长活化的聚乙二醇在水中的水解半衰期从而有望提高修饰效果如表2

2 PEG 化蛋白质的分离纯化

经PEG 修饰后的蛋白质是十分复杂的混合物这是由于

(1)PEG 聚合物分子量分布较宽,如PEG5000 的分子量分布在5000 500 道尔顿范围内

(2)由于被修饰蛋白质上待连接的活性位点的活性不同空间位阻不同导致每个蛋白分子上连接的PEG 数和PEG 连接的位置不同如超氧化物歧化酶(SOD)有20 个可能的PEG 连接位点理论上大约有2020 种不同的反应产物

(3)活化的聚乙二醇中还残留未反应的活化剂未活化的mPEG 等因此经PEG 修饰后的蛋白质必须进行分离纯化一般用色谱方法纯化PEG 化蛋白质连接PEG 后蛋白质的分子量有了不同程度的提高要想将其逐一分开体积排阻色谱(SEC)就成了首选的方法但SEC 分离同一数量级的物质效果不好所以对于分子量小且修饰位点少的多肽和小分子蛋白质该方法也不是很理想由于PEG为弱疏水性长链连接PEG 后蛋白质分子的疏水性有所增强所以也可以用反相高效液相色

谱(RP-HPLC)分离但其分离条件的摸索较为烦琐再者由于连接了PEG 蛋白质分子上的氨基等活性位点减少其等电点pH 都发生了变化所以用离子交换色谱(IEC)理论上也可以将其分离Malik 等的研究表明PEG 化蛋白质的纯化难度很大且纯化产量很低[10] Busby 和Ingham认为分离难度大的原因在于PEG 在水溶液中具有伸展构象其流体动力学体积远远大于同样分子量的蛋白质例如mPEG6000 不能通过截留分子量为12KD 的半透膜在体积排阻色谱中PEG6000 的行为类似于分子量25 35KD 的球状蛋白质[11] 采用切割分子量为30000Da 或50000Da 的超滤膜过滤可有效去除mPEG 但该方法不适用于小分子多肽迄今为止常用的分离方法是先用超滤或透析去除咪唑等小分子活化剂残余物然后再用

各种色谱法分离如 Snider 等用各种色谱法考察PEG-SOD 的多态性[12] Mcgoff 等用体积排阻色谱和离子交换色谱对PEG-SOD 进行分离及分析[13] 唐微等先利用硫酸铵对反应后的混合物进行蛋白质沉淀有效地去除了溶液中的PEG 然后再对离心出的蛋白质进行体积排阻色谱分离分离效果较以前好[11] 但该方法同样也不适于小分子多肽因为小分子多肽不容易被盐析沉淀另外Zhao 等用异丙醇沉淀活化后的聚乙二醇分子可有效去除反应时的极性溶剂和副产物活化聚乙二醇的收率达90%以上[23]

3 PEG 化蛋白质的表征与分析

PEG 化蛋白质的检测与分析至少应该有三个方面(1)蛋白的平均修饰度(2)PEG 修饰的位点及特定位点被修饰程度(3)不同修饰度的蛋白质的相对含量[14] 其中PEG 修饰的特定位点及特定位点被修饰程度的检测目前尚未见报道现将几种常用的检测分析方法介绍如下。

3.1 色谱法

如果用色谱法可以将聚乙二醇反应后的混合物逐一分离则可以绘制随浓度变化的工作曲线根据工作曲线来为各个组分定性及定量从而确定混合物的平均分子量和平均修饰度但由于PEG 化蛋白质的多样性以及PEG 在溶液中影响蛋白质的色谱行为色谱法分析并不是最好的分析方法其分辨率很低谱带宽且包含多种混合成分另外由于蛋白质的多样性定性

及定量也会有困难Snider 等分别利用高效离子交换色谱高效体积排阻色谱高效反相液相色谱等对PEG-SOD

作分析结果显示其分辨率很低不能将各种分子逐一分析谱带宽且杂乱[12] Mcgoff 用体积排阻色谱对PEG 化的SOD 进行分析SOD 为一尖锐的峰而PEG 化的SOD 则为一宽峰而且不能分离完全[13] 但对于修饰位点少的蛋白质或多肽而言色谱法效果较好如Brian Fenton等用RP-HPLC 对PEG-Hirudin(水蛭素)分析由于水蛭素只有三个修饰位点其产物较少可以很清楚的看出有三个峰分别为PEG-Hirudin (PEG)2-Hirudin (PEG)3-Hirudin[15]凝胶渗透色谱(GPC)属于凝胶色谱的一种凝胶色谱以多孔性填料为固相填料上有许多大小不一的孔径据样品的尺寸大小实现分离以有机溶剂(如甲苯四氢呋喃等)为流动相的称为凝胶渗透色谱以水溶液为流动相的称为凝胶过滤色谱有机相能很好的溶解大分子PEG Bullok 等用碱水解使蛋白质与PEG 分离再对水解下来的PEG 进行凝胶渗透层析通过测定PEG 的量以测修饰度[16] 但该方法可能因为水解不彻底和样品中含有游离的PEG 而受干扰。

3.2 SDS-PAGE 凝胶电泳法

凝胶电泳是蛋白质分析中十分常用的方法其分辨率高且可以测定分子量但该法在测定PEG 化蛋白质的分子量方面却存在很多缺陷由于PEG 在蛋白质表面的屏蔽作用和PEG 分子与凝胶分子的缠绕作用使PEG化的蛋白质在凝胶中的迁移速度减慢测出的分子量偏大Kurfurst用常规的电泳法测定PEG 修饰后的水蛭素分子量结果比理论值大一倍以上用碘化钡将PEG染色根据PEG 标准曲线测定分子量其值要准确的多Kurfurst 还用等电聚焦法分析PEG 修饰后的水蛭素证明有三种物质Hirudin PEG-Hirudin (PEG)2-Hirudin[17]另外用毛细管区带电泳对PEG 化蛋白质的分析也屡见报道由于蛋白质的疏水作用静电作用和其它多种两相分配机制毛细管中的蛋白质容易吸附在管壁上尤其是碱性蛋白质的

静电吸附最为突出这样使毛细管电泳的分离效率下降峰高降低甚至不出峰为克服蛋白吸附常采用化学方法来消除或覆盖管壁上的硅羟基使石英表面转化成高分子涂层[18] Cunico等通过改性剂使毛细管柱内壁带正电荷电渗流从通常的正极到负极方向变为负极到正极方向减少了蛋白在毛细管内壁的吸附同时也提高了分离度[19]

3.3 分光光度法

自从1960 年Satake 等介绍用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定蛋蛋白质氨基浓度以来该方法已成为测蛋白质修饰度最常用的方法TNBS 与蛋白质反应蛋白质的赖氨酸残基的氨基末端进攻TNBS 的磺酸基并将其取代形成的复合物有特定的光吸收以此测定其含量。

该方法简单易行因此得到广泛应用但该方法存在如下缺陷(1)TNBS 与蛋白质反应受pH 影响较大所以实验前应先测定最佳pH (2)对于较小的蛋白质该方法精确度不高但Snyder 等在此基础上对TNBS 法进行改造使该法精确性又有所提高[20]Stock 等采用荧光胺法测定修饰度荧光胺与蛋白质赖氨酸残基的氨基末端发生反应生成的产物有特定的光吸收通过测定蛋白质混合物所激发的荧光值来测定其平均修饰度该方法灵敏性很高仅需纳克级的蛋白质就能完成但这类方法所用的PEG 衍生物较昂贵不适于常规分析[21]

3.4 其它方法

质谱法是测定物质结构的重要手段近年来一种新型的质谱方法-基体辅助激光解析电离质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization MS, MALDI-MS)被成功地用于PEG 修饰蛋白组分的定性与定量分析该质谱最大特点是可以分析高分子量的生物大分子被测分子量可达50 万道尔顿红外光谱也是鉴别化合物确定分子结构常用的手段之一对单一组分或混合物中各组分也可以进行定量分析由于拉曼散射光的频率位移对应于分子的能级跃迁因此拉曼光谱也成为人们研究分子结构新的手段之一Bullock 等报道红外光谱测定相对而言较为快速直接不需要对样品进行预处理可以根据C O C 键的吸收强度给聚乙二醇定量但必须假设连接了SOD 和没有连接SOD 的聚乙二醇的C O C 键的吸收强度相同另外由于红外光谱对PEG-SOD 中的PEG 没有特征吸收所以游离PEG 的量需要用GPC 法检测并扣除而且该方法确定修饰度还需要知道精确的蛋白质含量这也可能成为误差来源拉曼光谱样品制作简单检验灵敏但同红外光谱有相同的缺点MALDI-MS 光谱与毛细管电泳谱十分相似但精确性比毛细管电泳差而且与红外光谱和拉曼光谱有同样的缺点[16]

4 蛋白质修饰展望

PEG 修饰技术在蛋白质药物的应用上起着越来越重要的作用目前已上市的药物有Enzon和Rhone-Poulenc Rorer 公司的抗癌药Oncaspar(PEG-L-ASP 天冬酰胺酶) 罗氏公司治疗丙肝病毒的PEG-Intron(PEG-IFN-a-2a) 已获FDA 批准用于多种严重免疫缺陷治疗的PEG-ADA(腺苷脱氨酶) 还有PEG-水蛭素等多种药物正处于临床实验阶段针对不同的酶多肽或蛋白选择适宜的PEG 活化和偶联方式以及相应的产物分离与检测方法各种方法都有其适用范围和局限性至今还没有通用的方法可供选择随着PEG 修饰技术研究的不断深入各种修饰特异性好修饰率高操作简便偶联产物稳定的活化剂不断涌现必将进一步提高聚乙二醇修饰蛋白质的特异性从而使产物的分离纯化和分析检测更加简单易行这是PEG 修饰技术发展的必然要求。